Clusterprofiler进行GSEA富集分析

我在利用R语言中clusterprofiler包进行GSEA富集分析时，采用的策略如下：利用count值进行Deseq2差异分析（两组数据，）——将差异分析中得到的所有DEG（未设阈值，取symbol和log2FC两列）导入R——利用clusterprofiler包分别对KEGG和GO进行GSEA
我的问题如下：
1.clusterprofiler分析的对象，即我导入的数据，是否可以是count值进行差异分析的结果？网络上有说需要用fpkm或是标准化处理，正确的数据应该是什么类型
2.利用差异分析得到的富集通路是否只能体现其中一组的富集情况。比如我的logFC是处理组比对照组，处理组上调的基因logFc为正值，那么富集到的基因是否主要是跟处理组有关？如果我想看对照组上调的通路，是否需要反过来再做一次差异分析，然后将处理组基因表达上调时对应FC为正值的基因与log2FC再做一次GSEA？
3.clusterprofiler与软件处理是否有区别？我自己处理的通路比公司送回的结果少了很多，不知道是什么原因

使用的代码如下，如果有需要补充的请回复我

setwd("C:/Users/25832/Desktop/liver picture")
因为GSEA只需要SYMBOL（基因名）和foldchange （或logFC)两列，所以可以把不需要的删掉。 代码未写，是将得到的差异分析结果中Symbol和Fc两行合并得到的data

library(org.Hs.eg.db)
library(clusterProfiler)
library(enrichplot)
df = read.csv(" .csv",header = T)
#转化ID
df_id<-bitr(df$SYMBOL, #转换的列是df数据框中的SYMBOL列
            fromType = "SYMBOL",#需要转换ID类型
            toType = "ENTREZID",#转换成的ID类型
            OrgDb = "org.Hs.eg.db")#对应的物种，小鼠的是org.Mm.eg.db
>'select()' returned 1:many mapping between keys and columns
df_all<-merge(df,df_id,by="SYMBOL",all=F) #使用merge合并
df_all_sort <- df_all[order(df_all$log2FoldChange, decreasing = T),]#先按照logFC降序排序
gene_fc = df_all_sort$log2FoldChange #把foldchange按照从大到小提取出来
head(gene_fc)
names(gene_fc) <- df_all_sort$ENTREZID #给上面提取的foldchange加上对应上ENTREZID

KEGG <- gseKEGG(gene_fc, organism = "mmu")
更详细的代码
GO <- gseGO(
  gene_fc, #gene_fc
  ont = "BP",# "BP"、"MF"和"CC"或"ALL"
  OrgDb = org.Mm.eg.db,
  keyType = "ENTREZID",
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod = "BH",#p值校正方法)
gseKEGG(
  geneList,
  organism = "hsa",
  keyType = "kegg",
  exponent = 1,
  minGSSize = 10,
  maxGSSize = 500,
  eps = 1e-10,
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod = "BH",
  verbose = TRUE,
  use_internal_data = FALSE,
  seed = FALSE,
  by = "fgsea",
  ...)
输出GSEA富集结果
sortGO<-GO[order(GO$enrichmentScore, decreasing = T),]#按照enrichment score从高到低排序
head(sortGO)
dim(sortGO)
write.csv(sortGO,"gsea_sortGO.csv")

GO<- setReadable(GO, OrgDb=org.Mm.eg.db,keyType = 'ENTREZID') 换成symbol名

TechWhizKid参考GPT回答：

  1. clusterProfiler可以接受差异分析的结果，但通常这些数据需要经过一定的标准化处理。对于RNA-seq数据，常见的标准化方法是FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)，RPKM (Reads Per Kilobase Million)，TPM (Transcripts Per Million)，等等。这些标准化方法都是为了在不同的样本之间进行比较时，消除测序深度和基因长度的影响。所以，你可以用DESeq2生成的差异表达基因(DEGs)，但是一定要确保你的数据已经被适当地标准化。

  2. 对于基因富集分析，通常情况下你得到的结果将反映差异表达基因在某个特定条件下（例如处理组）的富集情况。如果你的logFC是处理组相对于对照组，那么富集的基因集主要与处理组有关。如果你想看对照组中富集的通路，你可以在进行差异分析时将对照组和处理组的位置调换，这样得到的logFC将反映对照组相对于处理组的情况，然后你可以用这些结果进行基因富集分析。

  3. clusterProfiler和其他的一些商业软件在进行基因富集分析时可能存在一些差异。这可能是因为它们使用了不同的基因集、不同的统计方法、或者是因为它们使用了不同的p值调整方法等等。如果你发现你自己的结果和公司送回的结果之间存在很大的差异，我建议你首先检查你的分析流程是否正确，然后再尝试了解公司使用的具体的分析方法，以便能够更好地比较结果。

  • 另外，你的代码看起来没什么问题，但注意数据的预处理步骤和确保输入数据的正确性。特别是在转换基因ID时，bitr()函数可能返回多对多的映射，你需要确保你正确地处理了这种情况。而且在做GSEA分析时，gseKEGG() 和 gseGO() 的参数organism 和 OrgDb 应与你的研究物种一致。

基于new bing部分指引作答：
1、对于clusterprofiler包进行GSEA富集分析，你可以使用count值进行差异分析的结果作为输入数据。并不一定非要使用FPKM或标准化处理后的数据。clusterprofiler可以接受不同类型的基因表达数据作为输入，包括原始计数数据或标准化后的数据。

2、富集通路结果反映的是差异分析中具有显著差异的基因在特定通路中的富集情况。如果你的差异分析是处理组相对于对照组的比较，那么得到的富集通路结果主要反映处理组的富集情况。如果你想了解对照组的富集情况，可以反过来进行差异分析，将对照组作为处理组，处理组作为对照组，然后再进行GSEA分析。

3、clusterprofiler的分析结果可能会与其他软件或工具有所不同。这可能是由于不同的算法和统计方法的差异，以及使用的数据库和参考基因集的不同。此外，分析中的参数设置和数据处理步骤也可能影响最终的结果。如果你的分析结果与预期不符，可以仔细检查代码和参数设置，确保数据的正确性，并参考clusterprofiler的文档和示例代码来优化分析过程。

至于你提供的代码部分，看起来基本上是正确的，但有一处需要注意。在使用setReadable函数将基因ID转换为Symbol时，应该使用keyType = "ENTREZID"而不是keyType = 'ENTREZID'。代码中的最后一行应该修改为：

GO <- setReadable(GO, OrgDb = org.Mm.eg.db, keyType = "ENTREZID")

将'ENTREZID'改为"ENTREZID"即可。

希望这些解答能对你有所帮助！

结合AI回复：
1、ClusterProfiler分析的对象通常是基因表达矩阵，而差异分析的结果通常是基因的计数或FPKM值。虽然ClusterProfiler也支持其他数据类型，但建议在进行GSEA之前，先将基因表达矩阵转换为Count或FPKM值，并进行标准化或归一化处理，以确保数据分析的准确性和稳定性。
2、GSEA是一种基于基因集的富集分析方法，它可以考虑多个基因之间的关系以及它们在通路中的角色。因此，GSEA不仅可以分析差异表达基因，还可以发现基因集在不同条件下的富集情况。在进行GSEA时，您可以选择一个适当的参考基因集，如KEGG或GO基因集，以探究差异表达基因在哪些生物学过程中出现。在您的情况下，如果您想分析对照组上调的通路，您可以将DEGlist中的log2FC值取相反数，然后进行GSEA分析。
3、ClusterProfiler和软件处理的结果可能会有一些差异，这可能是由于数据预处理的不同、参数设置的差异、软件版本的更新等因素导致的。为了获得更准确和可靠的结果，建议您在进行分析时遵循最佳实践，并对结果进行适当的验证和解释。另外，您可以尝试使用其他软件包或工具进行GSEA分析，以比较不同方法的结果，从而获得更全面的见解。

来自GPT的回答：

针对您的问题，我逐个回答如下：

clusterProfiler 分析的对象可以是 count 值进行差异分析的结果。count 值是指每个基因在样本中的计数，它可以作为输入数据用于差异分析和富集分析。网络上的说法是，有时候在进行富集分析时，可能会对表达量进行标准化或转换成其他形式，以便更好地满足假设和统计要求。但这并不意味着 count 值不能用于富集分析，您可以直接使用 count 值进行 clusterProfiler 的 GSEA 分析。

利用差异分析得到的富集通路主要体现的是差异组（处理组）的富集情况。如果您想看对照组的富集情况，可以按照您提到的方法，将处理组基因表达上调的基因与对应的 log2FC 为正值的基因再进行一次差异分析，并将得到的基因作为输入进行 GSEA 分析。

clusterProfiler 的结果与其他软件处理结果可能存在差异。这可能是因为不同的软件使用了不同的算法、数据库或参数设置。在比较结果时，需要确保使用的数据和参数是一致的。另外，富集分析的结果也受到数据质量、统计方法和所选数据库等因素的影响。如果您发现与公司提供的结果有明显差异，可以仔细检查数据和代码，确保输入数据正确，并尝试调整参数或使用其他方法进行对比分析。

至于您提供的代码，除了数据导入和转换部分外，您已经正确使用了 clusterProfiler 的函数进行富集分析。最后，将结果输出为 CSV 文件是一个不错的做法，可以方便后续的分析和可视化。请注意，将 GSEA 的结果由 ENTREZID 转换为 SYMBOL 名需要使用 setReadable 函数，并指定 keyType 参数为 "ENTREZID"，然后再保存为 CSV 文件。

希望这些回答对您有帮助！如有更多问题，请随时提问。

  • 以下回答由chatgpt基于相关博客总结生成:

    对于这个问题，可以尝试重新安装igraph和graphlayouts包，方法如下：

    1.先关闭R并在文件浏览器中找到R的安装路径，在该路径下找到library文件夹。

    2.在library文件夹中找到igraph和graphlayouts文件夹，并将其删除。

    3.重新打开R，执行以下命令重新安装这两个包：

    install.packages('igraph',repos='http://cran.us.r-project.org')
install.packages('graphlayouts',repos='http://cran.us.r-project.org')

    如果以上方法不行，可以尝试强制重新安装org.Hs.eg.db包，方法如下：

    BiocManager::install("org.Hs.eg.db",force =TRUE)

    以上方法可能会解决GSEA富集分析中clusterprofiler包的加载问题。但如果仍然出现问题，建议查看具体报错信息并搜索相关问题解决方案。

GSEA富集分析流程及解释（R代码）
可以参考下
https://www.jianshu.com/p/d745e52979df

针对第一个问题，可以使用count值进行差异分析，将差异分析中得到的所有DEG（symbol和log2FC两列）导入R，然后使用clusterprofiler包进行GSEA分析。
针对第二个问题：如果想查看对照组上调的通路，那就需要做一次反向的差异分析，将处理组基因表达上调时对应的FC值为负值的基因与log2FC再做一次GSEA分析。
针对第三个问题：使用clusterprofiler与软件处理可能存在一些差异，因为不同的软件可能使用不同的算法和参数来进行GSEA富集分析。

结果再生产性