为什么western blot 内参一直深浅不一

有人能帮我看一下为什么我的内参跑成这样么，跑了好多次了，没有一次成功的
这是我的条件
上样量：50ug
GAPDH（1：100000）
凝胶浓度：10%
电泳：恒压80V 30min
恒压120v 1h
转膜：恒流150mA 50min
封闭：奶粉封闭4℃ 过夜
一抗孵育： 37℃ 1h
洗膜：五次 常温 10min
二抗孵育： 37℃ 1h（1：10000）
洗膜：五次 常温 10min